Für eine effiziente klinische Xenotransplantation werden mehrfach transgene Schweine benötigt, die sowohl protektive Xenogene exprimieren als auch eine Inaktivierung von mehreren porzinen Genen aufweisen. In den letzten Jahren wurde ein großer Fortschritt darin erzielt, die hyperakute Abstoßungsreaktion sowie auch teilweise die akut vaskuläre Abstoßungsreaktion zu verhindern. Die Hauptaufgabe besteht zurzeit darin, eine hohe und ubiquitäre Expression aller komplement-regulatorischen Gene zu erhalten und alle Modifikationen in einem einzigen Schwein zusammenzufassen.
In dieser Arbeit werden verschiedene Ansätze beschrieben, wie mehrere protektive Xenogene an einem genomischen Lokus kombiniert werden können. Eine dieser Möglichkeiten besteht in der Verwendung eines großen künstlichen Bakterienchromosoms (BAC), das die genomische Sequenz des komplement-regulatorischen Gens CD55 trägt und worauf weitere Gene wie das humane, blutgerinnungs-hemmende Gen Thrombomodulin und das T-Zell-regulatorische Gen LEA29Y bzw. die humanen anti-apoptotischen sowie anti-inflammatorischen Gene A20 und Häm-oxygenase 1 (HO1) hinzugefügt wurden. Durch diesen Ansatz können zwar mehrere Xenogene gleichzeitig transfiziert werden, jedoch besteht keine Möglichkeit die chromosomale Integrationsstelle vorab festzulegen.
Die in dieser Arbeit hergestellten Konstrukte wurden zusammen mit weiteren BAC bzw. PAC Konstrukten, welche die genomische Sequenz von humanem CD46 oder humanem CD59 trugen, transfiziert um einerseits künstliche humane Chromosomen (HAC) zu erzeugen, die eine Vielzahl an xeno-protektiven Genen tragen oder multi-transgene Zellen zu erzeugen, die eine große Anzahl an xeno-protektiven Genen gleichzeitig exprimieren.
Obwohl die Neubildung eines HACs nicht erreicht werden konnte, so konnte ein bereits bestehendes HAC durch den mikrozellen-vermittelten Chromosomentransfer erfolgreich von humanen in porzine Zellen übertragen werden. Diese Methode kann grundsätzlich auch dazu verwendet werden um komplette menschliche Chromosomen, die eine Vielzahl von xeno-protektiven Genen enthalten, in porzine Zellen zu übertragen.
Jedoch lieferten die Kotransfektionsexperimente eine große Anzahl an Zellklonen, die mehrere xeno-protektive Gene gleichzeitig exprimierten. Zellen mit den höchsten Expressionsniveaus der komplement-regulatorischen Gene wurden für den somatischen Kerntransfer verwendet. Daraus gingen zwei Gründertiere hervor, die eine hohe CD46 und CD55 Expression aufwiesen bzw. ein multi-transgenes Gründertier mit einer Expression von CD46, CD55, CD59, HO1 und A20. Die Analyse unterschiedlicher Gewebe zeigte die Expression der Transgene in fast allen Organen. Zusätzlich zeigte ein Test mit humanem Serum den vollständigen Schutz der multi-transgenen Zellen vor der komplement-vermittelten Zelllyse. Diese Zellen wurden darauffolgend durch eine Inaktivierung des GGTA1 Gens weiter modifiziert.
Ein weiterer Ansatz um transgene Tiere zu erhalten, die für die Xenotransplantation geeignet sind, bestand aus einer zielgerichteten Platzierung eines HO1 Konstruktes in dem gut zugänglichen porzinen ROSA26 Lokus. Über den somatischen Kerntransfer wurde ein transgenes Tier erzeugt, das eine ubiquitäre Expression von HO1 aufwies. Um herauszufinden, ob weitere Transgene am gleichen Lokus platziert werden könnten, wurde ein weiterer Vektor kloniert, der es erlaubt ein CAG-CD55 Minigen neben HO1 zu platzieren. Durch diesen Ansatz können mehrere Xenogene präzise nacheinander an einem einzigen genomischen Lokus platziert werden der eine Expression dieser Gene erlaubt.
Dies ist eines der ersten Beispiele welches zeigt, dass mehrere Xenogene sehr effizient an einem Lokus platziert und wie multi-modifizierte Schweine in einem einzigen Schritt erzeugt werden können. Durch die Vorauswahl der Zellen konnten Tiere geschaffen werden, deren Expressionslevel die besten veröffentlichen Ergebnisse übertreffen. Der verwendete Ansatz verhindert die Segregation der Transgene während der Züchtung wodurch sich die Anzahl der Versuchstiere drastisch verringert. In Verbindung mit der Inaktivierung des wichtigsten Xenoantigens, werden die Organe dieser Tiere die Xenotransplantation näher an die klinische Umsetzung heran bringen.
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Für eine effiziente klinische Xenotransplantation werden mehrfach transgene Schweine benötigt, die sowohl protektive Xenogene exprimieren als auch eine Inaktivierung von mehreren porzinen Genen aufweisen. In den letzten Jahren wurde ein großer Fortschritt darin erzielt, die hyperakute Abstoßungsreaktion sowie auch teilweise die akut vaskuläre Abstoßungsreaktion zu verhindern. Die Hauptaufgabe besteht zurzeit darin, eine hohe und ubiquitäre Expression aller komplement-regulatorischen Gene zu erha...
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