Molekulare Charakterisierung des myo-Inositol Metabolismus von Salmonella enterica serovar Typhimurium: Genetik, Transport und Regulation
Translated title:
Molecular Characterization of the myo-Inositol Metabolism of Salmonella enterica serovar Typhimurium: Genetics, Transport and Regulation
Author:
Kröger, Carsten
Year:
2010
Document type:
Dissertation
Faculty/School:
Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan
Advisor:
Th. M. Fuchs (PD Dr.)
Referee:
Liebl, W. (Prof. Dr.); Zäh, Michael F. (Univ. Prof. Dr.-Ing.), Abele, Eberhard (Univ. Prof. Dr.-Ing.)
Language:
de
Subject group:
BIO Biowissenschaften
Abstract:
In der vorliegenden Arbeit wurden die Genetik, der Transport und die Regulation des myo-Inositol-Metabolismus von Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) molekular charakterisiert.
Die iol-Gene von S. Typhimurium, die am myo-Inositol-Metabolismus beteiligt sind, liegen auf der genomischen Insel GEI4417/4436. Durch Deletionsanalysen wurden die Gene iolA, iolB, iolC1, iolC2, iolD2, iolE, iolG1 und STM4423 als essentiell für das Wachstum mit myo-Inositol als einziger Kohlenstoffquelle identifiziert. Bis auf STM4423 kodieren die genannten Gene für Enzyme, die myo-Inositol in Dihydroxyaceton-Phosphat, Acetyl-CoA und CO2 umwandeln. Laut RT-PCR Analyse bilden die Gene iolA und iolB, iolC1 und iolC2, iolD1 und iolD2, sowie iolE und iolG1 jeweils transkriptionelle Einheiten. Durch Fusion der iol-Promotoren an die Luciferase konnte gezeigt werden, dass die Promotoren von iolA/B, iolC1/C2, iolD1/D2 und iolE/G1 beim Wachstum mit myo-Inositol als Kohlenstoffquelle stark induziert werden. In LB-Medium oder Minimalmedium mit Glukose werden die iol-Promotoren mit Ausnahme des iolE/G1 Promotors durch den Regulator IolR reprimiert. In Protein-DNA Bindestudien konnte zudem gezeigt werden, dass IolR sowohl die übrigen iol- als auch seinen eigenen Promotor bindet und sich damit autoreguliert. Die Induktion der Gene iolE/G1 wird höchstwahrscheinlich durch den Regulator STM4423 vermittelt, da deren Expression den Wachstumsdefekt der STM4423-Deletion supprimieren kann.
Als myo-Inositol Haupttransporter in S. Typhimurium konnte IolT1 (STM4418) identifiziert werden. In Aufnahmeexperimenten mit radioaktiv markiertem myo-Inositol wurde ein Aktivitätsoptimum von IolT1 bei pH 5,5 und ein Km Wert zwischen 0,49 und 0,79 mM gemessen. Die stark reduzierte Aufnahme in Anwesenheit von Protonophoren deutet zudem darauf hin, dass IolT1 als myo-Inositol/H+-Symporter operiert. Als schwachen myo-Inositol-Transporter konnte IolT2 (STM4419) ausgemacht werden. Die Expression beider Transporter wird während des Wachstums mit myo-Inositol stark induziert und in LB-Medium und in Minimalmedium mit Glukose durch IolR-Bindung an die Promotoren von iolT1 und iolT2 reprimiert, was durch DNA-Protein Bindestudien gezeigt wurde.
Der Begriff der biologischen Bistabilität beschreibt das unterschiedliche Verhalten isogener Organismen unter identischen Bedingungen. Ein solcher bistabiler Phänotyp zeigt sich für das Wachstum von S. Typhimurium in Minimalmedium mit myo-Inositol als einziger Kohlenstoffquelle in der Variabilität einzelner Zellen bezüglich des Übergangs von der Anlauf- in die Wachstumsphase. Auf zellulärer Ebene konnte der bistabile Phänotyp beispielhaft an der iolE-Promotorinduktion mit Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie qualitativ und quantitativ gemessen werden. Sowohl die Deletion des Repressors IolR als auch CO2/Hydrogencarbonat im Medium heben die Bistabilität auf. Dabei wirkt CO2/Hydrogencarbonat nicht direkt auf IolR, sondern wahrscheinlich durch Bindung an STM4423, der dann das IolR-unabhängige Operon iolE/G1 induziert. Dieses Beispiel zeigt zum ersten Mal einen Einfluss von CO2/Hydrogencarbonat auf die Genregulation in S. Typhimurium. Die doppelte Regulation durch IolR und STM4423 ist für den myo-Inositol-Metabolismus der bisher untersuchten Organismen einzigartig. Aus den Daten dieser Arbeit konnte ein Modell für diese Regulation des myo-Inositol-Metabolismus in S. Typhimurium erstellt werden.
Translated abstract:
In this study, the genetics, the transport and the regulation of the myo-inositol metabolism of Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) are characterized on a molecular level.
The iol genes, which are involved in the myo-inositol metabolism, are encoded by the genomic island GEI4417/4436. By deletion, the genes iolA, iolB, iolC1, iolC2, iolD2, iolE, iolG1 and STM4423 were identified to be essential for growth with myo-inositol as the sole carbon source. Except for STM4423, the mentioned genes encode the enzymes, which degrade myo-inositol to dihydroxyacetone phosphate, acetyl-CoA and CO2. As investigated by RT-PCR, the genes iolA and iolB, iolC1 and iolC2, iolD1 and iolD2, as well as iolE and iolG1 form transcriptional units. By fusing the iol-promoters with the luciferase, it was shown that the promoters of iolA/B, iolC1/C2, iolD1/D1 and iolE/G1 are highly expressed during growth using myo-inositol as a C-source. In LB medium or in minimal medium containing glucose, all iol promoters except for the promoter of iolE/G1 are repressed by the regulator IolR. Using DNA-protein studies, IolR was shown to bind the remaining and its own promoter indicating its auto-regulation. The induction of the genes iolE/G1 is probably mediated by the regulator STM4423, since its expression suppresses the growth defect caused by the STM4423 deletion.
IolT1 (STM4418) could be identified to act as the main myo-inositol transporter in S. Typhimurium. An optimum of activity of IolT1 at pH 5,5 and a Km value between 0,49 and 0,79 mM was measured in uptake experiments using radio-labelled myo-inositol. The strong reduction of the uptake in the presence of protonophores suggests that IolT1 operates as a myo-inositol/H+ symporter. IolT2 (STM4419) was identified to be a weak myo-inositol transporter. The expression of these two transporters was strongly induced in cells growing with myo-inositol as a carbon source and repressed by IolR binding to their promoters in LB medium or minimal medium containing glucose, as shown by DNA-protein binding assays.
The term biological bistability describes the differential behaviour of isogenic organisms under identical conditions. Such a bistable phenotype could be observed for S. Typhimurium in minimal medium containing myo-inositol as the sole carbon source resulting in a variable transition of each single cell from the lag to the growth phase. On the cellular level, the bistable phenotype was measured as exemplified by the induction of the iolE promoter by fluorescence microscopy and flow cytometry in a qualitative and quantitative manner. The deletion of iolR as well as addition of CO2/bicarbonate to the medium abolishes the bistability. CO2/bicarbonate does not act on IolR, but probably mediates induction of the iolR-independent operon iolE/G1 by binding STM4423. This example shows for the first time an influence of CO2/bicarbonate on the gene expression of S. Typhimurium. The dual regulation of the myo-inositol metabolism by IolR and STM4423 is unique for all organisms investigated so far. A model of the regulation of the myo-inositol metabolism derived from the data presented in this study is postulated.
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