Optische Bildgebung der Autoimmunarthritis mit DiD markierten Leukozyten
Translated title:
Optical imaging of experimental arthritis using allogenic leukocytes labeled with a near-infrared fluorescent probe
Author:
Kau, Julia
Year:
2008
Document type:
Dissertation
Faculty/School:
Fakultät für Medizin
Advisor:
Rummeny, Ernst (Prof. Dr.)
Referee:
Rummeny, Ernst J. (Prof. Dr.)
Language:
de
Subject group:
MED Medizin
Keywords:
Optical imaging
Abstract:
Zielsetzung: Ziel der vorliegenden Studie war es, zu untersuchen, ob die Optische
Bildgebung nach Injektion von ex vivo DiD markierten Leukozyten, in der Lage ist, eine
Entzündung der Synovialmembran in Ratten mit einer Antigen-induzierten Monoarthritis des
rechten Kniegelenkes aufzudecken. Die Optische Bildgebung wurde auf ihre Fähigkeit zur
Unterscheidung zwischen arthritischen und gesunden Kniegelenken und zwischen nichttherapierten
und Kortison-therapierten Kniegelenken untersucht. Folglich untersuchten wir die Möglichkeiten der Optischen Bildgebung, eine Rheumatoide Arthritis zu diagnostizieren
sowie die Möglichkeit zur Beurteilung eines Therapie-verlaufs.
Material und Methoden: 12 Versuchstiere wurden für die in vivo Studie in zwei Gruppen zu jeweils 6 Tieren unterteilt. Bei allen Ratten wurde eine monoartikuläre Arthritis des rechten
Kniegelenkes induziert. Die Sensibilisierung erfolgte mit einer Emulsion von komplettem
Freudschen Adjuvant (Lee Laboratorios, Grayson, CA) und methyliertem bovinem
Serumalbumin (mBSA, 20mg/ml ,Sigma, St. Louis, MO). Nach 10 bis 20 Tagen erfolgte die
Induktion der Arthritis durch eine intraartikuläre Injektion von mBSA in das rechte
Kniegelenk. Zur Kontrolle wurde in das linke Kniegelenk dieselbe Menge an 0,9%NaCl (
Abbott Laboratories, North Chicago, IL) injiziert. Gruppe 1 wurde vor Kortisontherapie,
Gruppe 2 wurde nach Kortisontherapie mit der Optischen Bildgebung untersucht. Bei der
zweiten Gruppe wurde einen Tag nach dem Auftreten klinischer Zeichen einer Arthritis im
rechten Kniegelenk die Kortisontherapie eingeleitet. Am ersten Tag erfolgte eine Injektion
von 30mg/kg Solu-Medrol ( Methylprednisolone Sodium Succinat, 125mg/2ml, Pharmaciaa.
Upjohn CO, Kalamazoo,MI) intraperitoneal und für fünf weitere Tage eine intraperitoneale
Kortison-Injektion mit einer Dosis von 3mg/kg. Nach beendeter Therapie erfolgte für die
Gruppe 2 die optische Bildgebung.
Für jedes Versuchstier aus den Gruppen eins und zwei wurden autologe Leukozyten
gewonnen. Es wurde für jede Empfängerratte Blut von zwei Spenderatten benötigt, das
entspricht einer Leukozytenzahl von 3 bis 5x 108/ml. Die Markierung der Leukozyten erfolgte
in mehreren Schritten: Gewinnung von Serum aus den Vollblutproben, Gewinnung von
Leukozyten aus den Serumproben, Markierung der Leukozyten mit dem
Fluoreszenzkontrastmittel DiD( Vybrant® DiD cell-labeling solution,molecular probes,
Eugene,Oregon) und Inkubation des Zellansatzes mit anschließender Auswaschung des
Kontrastmittels. Jedem Versuchstier wurden die DiD markierte Leukozyten intravenös
injiziert. Von allen Versuchstieren beider Gruppen wurden eine native Aufnahme (prae),
direkt nach Injektion, 1 Stunde, 4 Stunden und 24 Stunden nach der Leukozyteninjektion
Aufnahmen mit der Optischen Bildgebung angefertigt. Bei vier Tieren (2 aus Gruppe 1, 2 aus
Gruppe 2) wurde zusätzlich noch eine 48 und 72 Stunden Aufnahme erstellt. Zusätzlich zu der
Optischen Bildgebung wurden von drei Tieren aus der ersten Gruppe und von zwei aus der
zweiten Gruppe Röntgenbilder angefertigt, um diese später mit den korrespondierenden
Optischen Aufnahmen zu überlagern.
Ergebnisse: Die optische Bildgebung zeigte bereits vor Leukozyteninjektion
Signalintensitätsunterschiede zwischen den arthritischen und den contralateralen normalen
Knien. Dies konnte deutlicher bei den nicht-therapierten Tieren als bei den Kortisontherapierten
Tieren beobachtet werden (P=0,047). Nach Injektion der DiD markierten
Leukozyten nahmen die Signalintensitätsunterschiede zwischen den arthritischen und den
normalen Knie sehr stark zu (P<0,05). Signifikant unterschiedliche Signalintensitätsmaxima
des rechten Kniegelenks im Vergleich zum contralateralen gesunden Kniegelenk konnten zum
Zeitpunkt von vier und 24 Stunden nach Injektion der DiD markierten Zellen beobachtet
werden. Bei allen nichttherapierten Tieren waren die Signalintensitäten deutlich erhöht
verglichen zum normalen Muskelgewebe. In allen sechs Kortison-therapierten Tieren, war
dieser Effekt geringer ausgeprägt als bei den nicht-therapierten Tieren (P>0,05). Die
behandelten Tiere zeigten ein A/N (Arthritis Knie/normalen Knie) Maximum vier Stunden
nach Zellinjektion. Zu diesem Zeitpunkt waren die A/N Quotienten der unbehandelten Tiere
signifikant erhöht verglichen mit den Ausgangswerten (P = 0,006) und signifikant
verschieden verglichen mit den Kortison-therapierten Tieren (P = 0,008). Dieser Effekt
bestand bei 24 p.i. fort, aber war geringer ausgeprägt als zum Zeitpunkt 4 h p,i.
Schlussfolgerung: Die optische Bildgebung von ex vivo DiD markierten allogenen
Leukozyten hat das Potential, Entzündungen der Synovialmembran bei der Antigeninduzierten
Arthritis aufzudecken und zu graduieren. Gleichzeitig besitzt die optische
Bildgebung die Fähigkeit, Therapieeffekte zu beobachten und im Verlauf darzustellen. Die
einfache Technik der Zellmarkierung und neue Entwicklungen von klinisch einsetzbaren
Fluoreszenzkontrastmitteln könnte den klinischen Einsatz dieser neuen bildgebenden
Methode in naher Zukunft, analog zur „Leukozytenszintigraphie“ auf nicht-invasive Weise
und ohne Strahlenbelastung für den Patienten, ermöglichen.
Translated abstract:
Optical Imaging of the Autoimmune-Arthritis with DiD labelled Leukocytes
Objectives: A goal of the available study was to find out whether the optical imaging has the
ability, after injection of ex vivo DiD marked leukocytes into the rat, to uncover an
inflammation of the Synovialis in the antigen induced model. We detect the optical imaging
for its ability to distinction between arthritic and normal knee joint and between untreated and
cortisone-treated knee joint. Therefore to find out if it is possible to diagnose with the optical
imaging a Rheumatoide Arthritis and if this were the case the possibility to observe a therapy
process.
Materials and methods: The 12 experimental animals were partitioned for the in vivo study
in two groups to in each case 6 animals. All rats were induced an antigen-mediated
monoarthritis of the right knee joint. Group 1 was examined before cortison treatment, group
2 after cortison treatment with the optical imaging. The monoarthritis was induced at both
groups in the same way. The sensitisation took place with an emulsion from complete Freud`s
adjuvant (Lee Laboratories, Grayson, GA.) and methylated bovine serum albumin (mBSA,
20mg/ml, sigma, ST. Louis, MO). After 10 to 20 days the arthritis was induced in the right
knee by an intra-articular injection of mBSA. The left knee served as an internal control and
received an intra-articular injection of sterile saline (Abbott Laboratories, North Chicago, IL).
The second group received cortison treatment before the optical imaging procedure. The
treatment was started after signs of an arthritis. The animals received at the first day
intraperitoneal injections of 30mg/kg Solu Medrol (Methylprednisolone Sodium Succinat,
125mg/2ml, Pharmacia. Upjohn CO, Kalamazoo, MI) and for five further days intraperitoneal
injections of 3mg/kg. For each experimental animal of group one and two allogenous
leukocytes were won. Each receiver rat needed blood by two donation rats, corresponds to a
leukocyte number from 3 to 5x 10 8/ml. The leukocytes labelling took place in several steps:
Production of serum from the full blood , production of leukocytes from the serum samples,
labelling the leukocytes with the fluorescence contrast dye DiD (Vybrant® DiD cell labelling
solution, molecular probes, Eugene, Oregon) and incubation of the cells with following
washing out the contrast dye. Then each experimental animal received an intravenous
injection of the DiD labelled leukocytes. A native image (prae), directly after injection, 1
hour, 4 hours and 24 hours after the leukocyte injection were made with the optical imager for
all experimental animals of both groups. With four animals (2 from group 1, 2 from group 2)
additionally still another 48 and 72 hours image was provided. Additionally to the optical
imaging x-rays were made from three animals of the first group and two of the second group,
in order to overlay those later with the corresponding optical imaging.
Results: Optical images demonstrated already before leukocyte injection differences in signal
intensity between the arthritic and the contralateral normal knees. This could be observed
increased in the untreated animals compared to treated animals (P=0,047). After injection of
the DiD labelled leukocytes the signal intensity differences between the arthritic and the
normal knees increased gradually and significantly for the untreated animals (P<0,05), but not
for the treated animals (P>0,05). The treated animals showed a peak A/N (Arthritis
knee/normal knee) at four hours after cell injection. At this time the A/N of the untreated
animals was significantly increased compared with the baseline values (P = 0.006) and
significantly differently compared with the cortisone-treated animals (P = 0.008). This effect
persisted at 24 post injection, but was less clear at 4 hour post injection.
Conclusion: The optical imaging of ex vivo DiD labelled allogenous leukocytes has the
potential to uncover inflammations in the synovia in the antigen-induced arthritis and to
graduate it. At the same time it has the ability to observe the effect mechanisms from
cortisone treatment and to represent its process. The simple technology of the cell labelling
and the use of clinically certified fluorescence contrast dyes could let the clinical employment
appear in the near future, similarly to the "leukocyte scan" as an not invasive way and without
radiation dose for the patient, possible.
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