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Originaltitel:
Strukturelle Charakterisierung von Thermoplasma acidophilum mittels Kryo-Elektronentomographie 
Übersetzter Titel:
Structural characterisation of Thermoplasma acidophilum by cryo-electron tomography 
Jahr:
2006 
Dokumenttyp:
Dissertation 
Institution:
Fakultät für Chemie 
Betreuer:
Baumeister, Wolfgang (Prof. Dr.) 
Gutachter:
Weinkauf, Sevil (Prof. Dr.) 
Sprache:
de 
Fachgebiet:
BIO Biowissenschaften 
Stichworte:
Thermoplasma acidophilum, Kryo-Elektronentomographie, makromolekularer Proteinatlas, archaeales Aktin-Homolog, Free-Flow Elektrophorese 
Übersetzte Stichworte:
Thermoplasma acidophilum, macromolecular protein atlas, cryo-electron tomography, archaeal actin homolog, free-flow electrophoresis 
Schlagworte (SWD):
Thermoplasma acidophilum; Elektronenstrahltomographie; Tieftemperaturtechnik 
TU-Systematik:
BIO 503d; BIO 040d 
Kurzfassung:
Ein Ziel der molekularen Strukturbiologie ist die Bereitstellung eines Proteinatlas, der Information über die räumliche Anordnung, die Konzentration und die Interaktionen von Proteinkomplexen in ihrer natürlichen ungestörten Umgebung enthält. Da nur im zellulären Kontext die Funktionen und die zugrunde liegenden Mechanismen, welche das Zusammenspiel der Makromoleküle steuern, verstanden werden können, benötigt man möglichst wenig-invasive Untersuchungsmethoden mit einer Auflösung im Nanometerbereich. Die zelluläre Kryo-Elektronentomographie ist momentan die einzige Abbildungstechnik, die es ermöglicht, dreidimensionale (3D) hochaufgelöste Einblicke in die supramolekulare Architektur von vitrifizierten Zellen in toto zu geben.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden intakte Zellen des Archaeons Thermoplasma acidophilum mittels Kryoelektronentomographie untersucht mit dem Ziel, einen makromolekularen Atlas der Zelle zu erstellen.
Ein limitierender Faktor in der Elektronentomographie sind die Abmessungen des zu untersuchenden Objektes in Durchstrahlungsrichtung. Zudem reduziert die intrinsisch hohe Proteindichte im Cytoplasma (Macromolecular Crowding) den Bildkontrast, was die Identifikation einzelner Makromoleküle in der Rekonstruktion mit dem momentanen Stand der Technik erschwert bzw. unmöglich macht. Deshalb wurde T. acidophilum bei unterschiedlichen Wachstumsbedingungen kultiviert, um die geeignetste Morphologie für die tomographische Datenaufzeichnung und nachfolgende Mustererkennung zu finden. Es wurden anaerobe Bedingungen gefunden, unter denen sich zum Teil besonders flache Zellen ausbildeten. Bei diesen Studien wurden in mehreren Tomogrammen von T. acidophilum Bündel von Filamenten innerhalb der Zelle beobachtet. Datenbanksuchen lieferten einige potentielle Kandidaten im Genom von T. acidophilum, die solche filamentöse Strukturen ausbilden könnten. Unter anderem auch das Protein Ta0583, ein archaeales Aktin-Homolog, welches mittels Elektronenmikroskopie und Röntgenstrukturanalyse weiter charakterisiert wurde.
T. acidophilum bietet sich als Modellsystem an, um mittels Kryo-Elektronentomographie und Mustererkennung die makromolekulare Architektur der Zelle zu untersuchen, da bereits mehrere Proteinstrukturen aus diesem Organismus bekannt sind und zusätzliche Informationen aus Genom- und Proteomanalyse verfügbar sind. Mit Hilfe der Free-Flow Elektrophorese wurden cytoplasmatische Proteine aus T. acidophilum, gemäß ihres isoelektrischen Punktes in zahlreiche Fraktionen aufgetrennt und anschließend elektronenmikroskopisch und massenspektrometrisch charakterisiert. Mit dieser Vorgehensweise wurde ein in T. acidophilum noch unbekannter hochmolekularer Proteinkomplex, die Ornithin Transcarbamoylase, gefunden. Dieser Proteinkomplex, bzw. die Struktur des homologen Proteins aus Pyrococcus furiosus, sowie das 70S Ribosom, das Thermosom und drei Proteasen (20S Proteasom, Tricorn und VAT) wurden mit Hilfe eines Mustererkennungsalgorithmus, der auf Kreuzkorrelation beruht, anhand ihrer strukturellen Signatur im Tomogramm einer Zelle lokalisiert. 
Übersetzte Kurzfassung:
One aim of molecular structural biology is to provide a macromolecular atlas that describes the spatial arrangements, concentrations and interactions of specific subsets of protein complexes in the unperturbed cellular environment. Such atlases would be most beneficial for analysing protein interaction networks in a cellular context. At present, cryo-electron tomography is the only available imaging technique capable of allowing a glimpse into the three-dimensional (3D) supramolecular architecture of vitrified cells in toto with a resolution in the nanometre range.
In this work, intact cells of the archaeon Thermoplasma acidophilum were investigated by cryo-electron tomography with the objective of generating a protein atlas on a macromolecular level.
A limiting factor for electron tomography is the size of the investigated object. In addition, the intrinsic high protein density within the cytoplasm ('macromolecular crowding') reduces the image contrast, which hampers the identification of single macromolecules in the tomographic reconstructions using state-of-the-art techniques. For this reason, T. acidophilum was cultured under various growth conditions to obtain the most suitable morphology for recording tomographic data and for subsequent template matching. Cells grown under anaerobic conditions turned out to be particularly flat. During these studies, filaments forming bundles inside the cell could be observed in several tomograms. Databank searches revealed multiple potential candidates in the genome of T. acidophilum that could be responsible for such filamentous structures, including the protein Ta0583, an archaeal actin homolog, which was further characterised by electron microscopy and by X-ray crystallography.
T. acidophilum is well suited as a model system to study the macromolecular architecture of the cell with cryo-electron tomography and pattern recognition, since several protein structures have been solved from this organism. Other benefits include the completely sequenced genome and ongoing proteomics studies. To carry out structural proteomic analysis on T. acidophilum, cell lysates were fractionated using free-flow electrophoresis. This technique separates the cytoplasmic proteins into numerous fractions according to their respective isoelectric points. Single fractions were then investigated by electron microscopy and mass spectrometry. With this approach, it was possible to identify the hitherto unknown macromolecular protein complex ornithine carbamoyltransferase in T. acidophilum. The structure of the homologous protein from Pyrococcus furiosus, as well as the 70S ribosome, the thermosome and three proteases (20S proteasome, tricorn and VAT) were mapped inside the tomogram of an intact cell by means of a pattern recognition algorithm based on cross correlation. 
Mündliche Prüfung:
09.11.2006 
Dateigröße:
85925459 bytes 
Seiten:
162 
Letzte Änderung:
24.10.2008