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Original title:
Stabilisotopen-Markierungsstudien zur Klärung von Strukturen und Bildungsabläufen der Maillard-Reaktion von Lysin-Seitenketten in Proteinen 
Translated title:
Elucidation of Structures and Reaction Mechanisms of the Maillard Reaction regarding Lysine side chains in Proteins by applying Stable Isotopic Labeling Strategies 
Year:
2019 
Document type:
Dissertation 
Institution:
Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan 
Advisor:
Hofmann, Thomas (Prof. Dr.) 
Referee:
Hofmann, Thomas (Prof. Dr.); Rychlik, Michael (Prof. Dr.) 
Language:
de 
Subject group:
NAT Naturwissenschaften (allgemein) 
TUM classification:
CHE 513d 
Abstract:
Die zwischen reduzierenden Kohlenhydraten und Aminosäuren, Peptiden und Proteinen ablaufende Maillard-Reaktion zählt zu den wichtigsten nicht-enzymatischen Stoffumwandlungsreaktionen bei der Lebensmittelverarbeitung und trägt maßgeblich zur Bildung von Aromastoffen, Geschmacksstoffen und Bräunungsprodukten bei. Die Beobachtung, dass die Maillard-Reaktion auch bei pathophysiologischen Prozessen in vivo eine Schlüsselrolle spielt, hat in den letzten Jahren ein zunehmendes Interesse an den nicht-enzymatisch gebildeten Modifikationen von Protein-Seitenketten geweckt. Allerdings sind die z.B. an Lysin-Seitenketten ablaufenden Reaktionen bislang nur rudimentär auf molekularer Ebene verstanden. Um die Maillard-Modifikationen der ε-Aminoseitenkette von proteingebundenem Lysin zu studieren, wurden Glucose und Nα-Acetyl-Lysin in wässrigen Modellsystemen inkubiert und durch Anwendung verschiedener chromatographischer Trenntechniken zunächst 14 Verbindungen isoliert. Zur Strukturaufklärung dieser Verbindungen kam neben der NMR-Spektroskopie die Massenspektrometrie zum Einsatz. Um die Strukturvorschläge abzusichern und erste Einblicke in die zugrunde liegenden Bildungsmechanismen zu erlangen, kamen zwei Stabilisotopenmarkierungstechniken zum Einsatz: CAMOLA (Carbon Module Labeling)- und CBL (Carbon Bond Labeling)-Technik. Für den CAMOLA-Ansatz wurde das Edukt Glucose zu 50% unmarkiert und zu 50% ubiquitär 13C6-markiert eingesetzt. Nach erfolgter Aufreinigung und Isolierung wurden die Verbindungen massenspektrometrisch mittels der UPLC-ToF/MS analysiert. Durch den Einsatz von 50% ubiquitär 13C6-markierter Glucose wiesen die Verbindungen, welche aus der Glucose bzw. aus Fragmenten der Glucose aufgebaut waren, verschiedene Isotopenmuster bzw. –pattern auf, die massenspektrometrisch detektiert wurden. Der CBL-Ansatz beinhaltete im Gegensatz dazu nur 5% ubiquitär 13C6-markierte Glucose. Nach erfolgter Aufreinigung und Isolierung wurden die Verbindungen des CBL-Ansatzes NMR-spektroskopisch untersucht. Für die meisten Verbindungen wurden 13C-Spektren aufgenommen, bei denen aufgrund der Verwendung von 5% ubiquitär 13C6-markierter Glucose homonukleare Kopplungen zwischen den Kohlenstoff-Atomen sichtbar waren, welche blockweise aus der Glucose in die Zielverbindungen übertragen wurden. Von den isolierten Verbindungen waren sechs bereits als Strukturanaloga bekannt, weshalb auf Bildungsmechanismen z.T. zurückgegriffen werden konnte. Sieben Verbindungen waren bisher noch nicht bekannt, weshalb es umso wichtiger war, sowohl zur Strukturverifizierung als auch zur Aufklärung der Bildungsmechanismen auf die Erkenntnisse aus den Stabilisotopenmarkierungsstrategien zurückgreifen zu können. Um die Bildungsverläufe der identifizierten Maillard-Reaktionsprodukte zu studieren, wurden in einem weiteren Schritt Kinetik-Ansätze bei Temperaturen von 80 °C und 37 °C inkubiert. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden Aliquote entnommen und massenspektrometrisch nach Etablierung von ECHO-LC-MS/MS-Methoden analysiert. Ausgewählte Maillard-Modell-Ansätze mit Hilfe der CAMOLA- und der CBL-Technik zu analysieren, stellt eine äußerst hilfreiche Methode bei der Strukturaufklärung unbekannter und der Strukturverifizierung bereits bekannter Verbindungen dar. Darüber hinaus ließen sich dadurch wichtige Informationen bezüglich der Bildungsmechanismen gewinnen, wodurch nicht nur neue Bildungsmechanismen postuliert, sondern auch z.T. bereits postulierte Reaktionsabläufe korrigiert werden konnten. Diese Arbeiten legen somit neue Grundlagen zum besseren molekularen Verständnis von Lysinseitenkettenreaktionen von Proteinen unter physiologischen Bedingungen. 
Translated abstract:
The reaction between reducing sugars and amino acids, peptides and proteins – which is known as Maillard Reaction – has to be deemed as one of the most important non-enzymatic reactions concerning food processing and significantly gives rise to the formation of aroma, taste and colored compounds. Knowing that the Maillard Reaction does also play a crucial role as far as pathophysiological processes in vivo are concerned, has led to increased attentions of non-enzymatic modifications of protein side chains within the last years. Yet, on molecular base modifications affecting Lysine side chains are only partially understood. To study modifications of the Maillard Reaction of the ε-amino side chain of protein bound Lysine, Glucose and Nα-Acetyl-Lysine have been incubated in aqueous model systems and have been purified chromatographically whereby 14 compounds could be identified. For structure determination either NMR spectroscopy as well as Mass spectrometry has been used. In order to support structure determination and to clarify the reaction mechanisms, two stable isotope labeling experiments have been implemented: CAMOLA (Carbon Module Labeling)- and CBL (Carbon Bond Labeling)-Technique. Regarding the CAMOLA-approach 50% of unlabeled Glucose and 50% of ubiquitary 13C6-labeled Glucose has been used. After chromatographic purification and isolation, distinct compounds have been analysed by means of UPLC-ToF/MS. Due to the usage of 50% ubiquitary 13C6-labeled Glucose compounds being derived from Glucose or bearing fragments of the latter revealed different isotopic patterns that could be detected by Mass spectrometry. In contrast the CBL-approach only contained 5% of ubiquitary 13C6-labeled Glucose. After chromatographic purification and isolation, distinct compounds have been analysed by means of NMR-spectroscopy. Since 5% ubiquitary 13C6-labeled Glucose was used, 13C-spectra for most of the compounds could be recorded showing homonuclear couplings between carbon atoms that were en bloc transferred from Glucose into the respective compounds. Six out of the 14 compounds have been described so far – at least as derivatives; for this reason, reaction mechanisms have been known. Yet, seven compounds have not been described. For structure verification and clarification of the reaction mechanisms it has therefore been conducive to refer to the results of the stable isotopic labeling experiments. To gain insight into the formation of the identified Maillard Reaction compounds over time, kinetic approaches have been conducted at temperatures of 80 °C and 37 °C. After distinct time intervals aliquots have been taken and analysed by Mass spectrometry using an ECHO-LC-MS/MS method. The CAMOLA- and the CBL-Technique pose a very powerful tool to study Maillard model systems as far as structure determination of unknown compounds and structure verification of known compounds is concerned. Moreover, it was feasible to attain important information regarding reaction mechanisms, which in turn not only led to the postulation of new reaction mechanisms, but also to the revision of already known reaction mechanisms. Therefore, this work contributes to a better understanding of Lysine side chain reactions of proteins under physiological conditions. 
Series:
Lebensmittelchemie 
ISBN:
978-3-8439-4137-2 
Oral examination:
09.07.2019 
Last change:
13.09.2019