Compound attrition is one of the main reasons for the increasing costs of drug discovery projects. Many candidate drug molecules fail because they do not reach the site of action, the target is not engaged by the compound so that binding does not result in a pharmacologically relevant phenotype. Further, adverse events are often caused by off-target activities not discovered with standard assay panels. For small molecules acting on protein targets, chemoproteomic assays combined with mass spectrometry enable the proteome-wide identification of drug targets including undesired binders. In contrast to lysate- and recombinant protein-based assays, cellular assays also interrogate if the cell membrane is crossed and the relevant compartment is accessed. Cell-based chemoproteomics assays can assess dose-dependent engagement of endogenously expressed targets under physiologically relevant conditions. The recent clinical success of targeted covalent kinase inhibitors has led to increased interest in irreversible binding mechanisms across the pharmaceutical industry and academic research. A covalent mode of action can increase target selectivity and provide good potency at low dosing as well as reduce the risk of drug resistance development. Targeted covalent inhibitors are characterized by moderate target affinity paired with low reactivity towards very conserved nucleophilic amino acid side-chains. Concerns about off-target mediated idiosyncratic toxicity are limited since the compound should only react if precisely positioned towards a suitable amino acid present in only a small subset of the proteome. How well commonly applied lysate-based target engagement and selectivity assays reflect the intracellular compound/target binding and reactivity is less clear. This thesis focusses on the characterization of targets and off-targets of covalent inhibitors using chemoproteomic techniques in cell extracts and in living cells. It is demonstrated that for covalent inhibitors cell-based experiments reflect target potency and selectivity much better than lysate based experiments. Using a cell-based kinobeads assay and comparing it to a lysate-based variant displayed distinct differences in potency for covalent targets determined with both settings. This allowed to establish a differential kinobeads selectivity profiling strategy that discriminates covalent and reversible kinase targets. This approach was then applied to assess the selectivity of clinically relevant targeted covalent kinase inhibitors such as Ibrutinib and Afatinib. The outcomes were compared to alternative approaches for measuring target engagement including an intracellular competition binding strategy using bioorthogonal chemistry as well as the recently established cell-based thermal proteome profiling and multiplexed proteome dynamics profiling. Due to non-equilibrium binding covalent probes might also represent valuable tool compounds for measuring target engagement of reversible inhibitors by competition binding experiments in live cells. In the second part of this thesis, differential kinobeads selectivity profiling was used to assess a generic strategy for the synthesis of covalent probes from promiscuous protein inhibitors. Different reactive moieties were coupled to non-selective inhibitors to bind an amino acid positioned close to the inhibitor binding site. It was evaluated if such an approach might aid the future design of targeted covalent inhibitors and if the generated probes enable intracellular competition binding assays for target engagement measurements of reversible protein inhibitors. With this strategy, a covalent MAPK9 probe was synthesized and used for demonstrating the concept of measuring intracellular target engagement of the reversible inhibitor Tanzisertib.     «

Compound attrition is one of the main reasons for the increasing costs of drug discovery projects. Many candidate drug molecules fail because they do not reach the site of action, the target is not engaged by the compound so that binding does not result in a pharmacologically relevant phenotype. Further, adverse events are often caused by off-target activities not discovered with standard assay panels. For small molecules acting on protein targets, chemoproteomic assays combined with mass spectr...     »

Das erst späte Ausscheiden neuer Wirkstoffe während deren Erforschung ist einer der Hauptgründe steigender Medikamentenkosten. Sie scheitern, da viele Wirkstoffkandidaten ihr biologisches Zielmolekül nicht erreichen oder binden und somit keinen pharmakologisch relevanten Effekt induzieren. Zudem führen unerwartete Interaktionen des Wirkstoffes mit Biomolekülen, welche mit gängigen Testverfahren nicht entdeckt werden, oftmals zu unerwünschten Nebenwirkungen. Chemoproteomische Analysestrategien in Kombination mit massenspektrometrischen Messverfahren ermöglichen die proteomweite Identifizierung erwünschter und ungewollter Protein-Wirkstoff-Interaktionen. Im Gegensatz zu Methoden, die auf Zelllysat oder rekombinanten Proteinen basieren, geben zelluläre Tests auch Auskunft darüber, ob ein Wirkstoff die Zellmembran durchdringt und seinen Wirkort erreicht. Außerdem ermöglichen sie die Analyse, welche endogen exprimierten Proteine gebunden werden. Durch den aktuellen klinischen Erfolg kovalenter Kinaseinhibitoren hat das Interesse an irreversiblen Bindungsmechanismen in der pharmazeutischen Industrie und der akademischen Forschung zugenommen. Das kovalente Binden an ein Protein kann in gesteigerter Selektivität und hoher Bindungsstärke bei geringer Wirkstoffgabe resultieren und das Risiko für Resistenzentwicklungen verringern. Bedenken bezüglich unerwünschter Nebenwirkungen aufgrund unspezifischer Reaktivität werden durch das Konzept sogenannter „targeted covalent inhibitors“ reduziert. Diese Inhibitoren vereinen moderate Bindungsaffinität für ein Protein mit einer schwach reaktiven Gruppe, welche nach präziser Positionierung mit stark konservierten, nukleophilen Aminosäuren reagieren kann. Inwiefern die mit lysatbasierten Assays ermittelte Selektivität und Reaktivität solcher Inhibitoren mit der tatsächlichen zellulären Situation korrelieren ist unklar. Diese Doktorarbeit widmet sich der Charakterisierung kovalenter Proteininhibitoren mittels chemoproteomischer Verfahren in Zelllysaten und lebenden Zellen. Es wird gezeigt, dass zellbasierte Testverfahren die Bindungsstärke und -selektivität kovalenter Proteininhibitoren besser widerspiegeln als lysatbasierte Experimente. Unterschiede in der Stärke kovalenter Proteinbindungen, gemessen mit einem zellbasierten Kinobeads Assay und einer lysatbasierten Variante, wurden ausgenutzt, um ein Verfahren zur differentiellen Analyse kovalenter und reversibler Proteinbindungen aufzusetzen. Mit diesem Ansatz wurde die Selektivität klinisch relevanter kovalenter Kinaseinhibitoren, einschließlich Ibrutinib und Afatinib, untersucht. Die Ergebnisse werden mit alternativen Methoden zur Charakterisierung von Wirkstoff-Protein-Interaktionen basierend auf bioorthogonaler Chemie, thermischer Proteinstabilität und proteasomaler Degradierung verglichen. Aufgrund der irreversiblen Bindung können reaktive Moleküle auch genutzt werden, um intrazelluläre Proteininteraktionen nicht-kovalenter Wirkstoffe in Kompetitionsexperimenten zu untersuchen. Das reversible Bindungsgleichgewicht kann dabei mit Hilfe des kovalenten Mechanismus während der Probenaufbereitung stabilisiert werden. Im zweiten Teil dieser Dissertation wurde die Kinobeads-basierte differentielle Analyse kovalenter und reversibler Proteinbindungen angewandt, um eine Strategie für die Synthese kovalenter Moleküle auf Basis unselektiver Proteininhibitoren zu bewerten. Dazu wurden verschiedene reaktive Inhibitoranaloga synthetisiert, um mit Aminosäuren nahe der Inhibitorbindungsstelle zu reagieren. Es wurde untersucht, ob dieser Ansatz die Synthese neuer kovalenter Proteininhibitoren unterstützen kann oder ob sich die generierten Moleküle zur intrazelluläre Analyse reversibler Proteinbindungen eignen. Auf Basis eines so synthetisierten kovalenten Moleküls und des MAPK9 Inhibitors Tanzisertib wird ein Konzept zur Bestimmung reversibler Proteininteraktionen in lebenden Zellen demonstriert.     «

Das erst späte Ausscheiden neuer Wirkstoffe während deren Erforschung ist einer der Hauptgründe steigender Medikamentenkosten. Sie scheitern, da viele Wirkstoffkandidaten ihr biologisches Zielmolekül nicht erreichen oder binden und somit keinen pharmakologisch relevanten Effekt induzieren. Zudem führen unerwartete Interaktionen des Wirkstoffes mit Biomolekülen, welche mit gängigen Testverfahren nicht entdeckt werden, oftmals zu unerwünschten Nebenwirkungen. Chemoproteomische Analysestrategien in...     »