Eines der zentralen Themen der mikrobiellen Ökologie ist die Erfassung von Strukturen komplexer, mikrobieller Lebensgemeinschaften sowie das Verständnis ihrer Funktionsweisen. Um diese Fragestellung sinnvoll bearbeiten zu können, bedarf es neuer, molekularer Nachweissysteme, mit denen in einem Versuchsschritt zahlreiche Mikroorganismen innerhalb des untersuchten Systems phylogenetisch identifiziert und deren Funktionen geklärt werden können. Die vorliegende Arbeit zeigt u.a. die Entwicklung, Evaluierung und Anwendung eines neuartigen molekularen Werkzeugs für derartige Struktur-Funktions-Analysen, des sog. Isotope Arrays. Die Methode beruht auf der Kombination der hoch parallelen Identifizierung von Mikroorganismen mittels der Mikroarray-Technologie, und dem spezifischen Nachweis der Inkorporationsaktivität von Isotop-markierten Substraten in Nukleinsäuren von Organismen, welche auf dem Mikroarray identifizierter werden. Als Modellorganismen dienten hierfür die Ammoniak oxidierenden Bakterien (AOB), welche weltweit in natürlichen sowie anthropogenen Lebensräumen vorkommen und eine wesentliche Rolle im globalen Stickstoffkreislauf spielen. Da alle Vertreter dieser Bakteriengruppe in der Lage sind, autotroph zu leben, und somit in ihrem aktiven Zustand durch Zugabe von radioaktiven CO2 markiert werden können, eignen sie sich besonders für die Austestung des Isotope-Array-Ansatzes. Um die Realisierbarkeit dieser Methodik zu überprüfen („proof of principle“), wurde zunächst ein Prototyp des Isotope Arrays mit einer geringen Anzahl an bereits publizierten und gegen die 16S rRNS von AOB gerichteten Oligonukleotidsonden konstruiert. Im ersten Schritt wurde die rRNS von einer Nitrosomonas-eutropha-Reinkultur, welche mit 14C-markiertem Bikarbonat inkubiert wurde, auf dem Mikroarray hybridisiert. Das Signalmuster für Fluoreszenz bzw. Radioaktivität zeigte sowohl Präsenz als auch Assimilationsaktivität von N. eutropha an. Im Kontrollversuch mit rRNS von N. eutropha, welche zusätzlich zu 14C-Bikarbonat mit dem spezifischen Nitrifikationshemmstoff Allylthioharnstoff inkubiert wurde, blieben die radioaktiven AOB-Sondensignale aus. Nachdem es gelang, den spezifischen Einbau von 14C-Bikarbonat in rRNS von N. eutropha auf dem Isotope Array eindeutig zu zeigen, wurden Versuche mit nitrifizierenden Belebtschlämmen zweier Kläranlagen durchgeführt. Zunächst wurde die Populationstruktur beider Belebtschlämme mit quantitativer FISH- sowie vergleichender amoA-Gensequenzanalyse untersucht. Ferner wurde über einen Zeitraum von 26 h die 14CO2-Assimilationsaktivität der Nitrifikanten in beiden Belebtschlämmen (mit und ohne Zugabe von Allylthioharnstoff) mit Hilfe der Szintillationsmessung überwacht. In beiden aktiven Belebtschlämmen konnte ein kontinuierlicher Radioaktivitätsanstieg in der Biomasse beobachtet werden; kein nennenswerter Radioaktivitätseinbau fand hingegen in die gehemmte Biomasse statt. Zusätzlich wurde die CO2-Assimilation beider Belebtschlämme mit Hilfe der FISH-MAR-Analyse untersucht. Beide aktiven Schlämme zeigten eine eindeutige Akkumulation von Radioaktivität an den Nitrifikantenkolonien, wohingegen nach Inhibition keine vergleichbare Radioaktivitätsanhäufung lokalisiert wurde. Die Resultate der im Anschluss durchgeführten Hybridisierungen auf dem Prototyp des Isotope Arrays mit rRNS beider Belebtschlämme bestätigten die Befunde der Kontrollversuche hinsichtlich Präsenz und Aktivität von AOB in beiden Proben. Um mit dem Isotope Array künftig alle bekannten AOB zu erfassen, wurde im folgenden Schritt ein aus 123 überwiegend neuen, gegen die 16S rRNS gerichteten und AOB-spezifischen Oligonukleotiden bestehender Sondensatz gemäß dem Mehrfachsondenkonzept entworfen, und mit über 30 PCR-amplifizierten sowie in-vitro-transkribierten 16S-rRNS-Genen von AOB-Reinkulturen evaluiert. Trotz der zum Zeitpunkt seiner Evaluierung herrschenden, ungünstigen Umstände, wie hoher Raumtemperatur und Fehlfunktionen des Arrayspotters, konnte prinzipiell die Tauglichkeit des neuen AOB-Mikroarrays bestätigt werden. Als nächstes wurde die Eignung des neuen AOB-Mikroarrays für den Isotope-Array-Ansatz überprüft. Die für den Prototyp des Isotope Arrays bereits verwendete, radioaktiv- und fluoreszenzmarkierte rRNS aus Belebtschlämmen zweier Kläranlagen wurde auf dem neuen Isotope Array hybridisiert. Dabei konnte grundsätzlich festgestellt werden, dass die auf dem Isotope-Array-Prototyp durchgeführten Struktur-Funktions-Analysen der beiden Proben mit dem Isotope Array bestätigt werden konnten. Gleichzeitig muss jedoch erwähnt werden, dass zum einen die Stringenzbedingungen einer weiteren Feinabstimmung bedürfen, und zum anderen, dass, aufgrund von – vermutlich durch Fehlfunktionen des Arrayspotters verursachtem – Signalausfall einzelner Sonden, einige Hybridisierungen mit AOB-Reinkulturen wiederholt werden sollten. Insgesamt betrachtet erwies sich jedoch der Isotope Array als ein effizientes, molekulares Werkzeug für Struktur-Aktivitäts-Analysen von AOB, die in den untersuchten Proben in Häufigkeiten zwischen 5-10% vorkamen. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurde auch versucht, Unterschiede der Zusammensetzung von AOB-Lebensgemeinschaften in Böden mit unterschiedlicher Düngungspraxis mit Hilfe des AOB-Mikroarrays aufzuzeigen. Da jedoch die Diversitätsunterschiede vor allem unterhalb des Speziesniveaus und damit jenseits der Auflösungsgrenze des AOB-Mikroarrays lagen, wurden AOB-Populationsstudien der beiden Böden mittels der vergleichenden amoA-Gensequenzanalyse durchgeführt. Der Vergleich der AOB-Populationsstruktur des ungedüngten mit dem mit Stallmist gedüngten Boden zeigte, dass die Unterschiede auf niedriger phylogenetischer Ebene, also vermutlich auf Stammesebene lagen, und dass der ungedüngte Boden eine höhere Anzahl an OTU (=operational taxonomic units) AOB als der gedüngte Boden beherbergte. Eine weitere Untersuchung von AOB-Besiedlungsunterschieden mit Mikroskalaauflösung, d.h. unter Berücksichtigung der einzelnen Korngrößenfraktionen, wie Grob- und Feinsand, Schluff und Ton, zeigte hingegen deutlich, dass die AOB-Diversität sowohl im gedüngten als auch im ungedüngten Boden mit abnehmender Partikelgröße zunahm. Die Beobachtung, dass einige OTUs in nahezu allen Fraktionen beider Böden vorkamen, während andere nur auf einen Bodentyp oder wenige Fraktionen beschränkt blieben, deutetet zudem darauf hin, dass die detektierten AOB in zwei Strategentypen, nämlich im Generalisten bzw. Spezialisten unterteilt werden konnten. Die faszinierende Vielfalt AOB in den untersuchten Böden demonstrierte uns einerseits, dass für die Erforschung von so hochkomplexen Lebensgemeinschaften weitere Experimente mit einer höheren Anzahl an Replikaten erforderlich sind, um die gegenwärtigen Befunde abzusichern. Andererseits wurde erneut deutlich, dass die molekulare mikrobielle Ökologie des Bodens eine noch relativ junge Disziplin mit großem Forschungsbedarf und zahlreichen, spannenden und noch zu erörternden Fragestellungen darstellt.     «

Eines der zentralen Themen der mikrobiellen Ökologie ist die Erfassung von Strukturen komplexer, mikrobieller Lebensgemeinschaften sowie das Verständnis ihrer Funktionsweisen. Um diese Fragestellung sinnvoll bearbeiten zu können, bedarf es neuer, molekularer Nachweissysteme, mit denen in einem Versuchsschritt zahlreiche Mikroorganismen innerhalb des untersuchten Systems phylogenetisch identifiziert und deren Funktionen geklärt werden können. Die vorliegende Arbeit zeigt u.a. die Entwicklung, Eva...     »

Deciphering the structure and function of complex microbial communities is one of the central themes in microbial ecology. Therefore, new molecular detection systems are required, which allow the investigation of phylogeny and function of numerous microorganisms in one step. This work presents the development, evaluation and application of a novel molecular tool for structure-function analyses called the Isotope Array. This approach merges two methods: the highly parallel microarray technique for the identification of microorganisms, and the detection of specific incorporation activity of isotope-labeled substrates into nucleic acids for the investigation of the function of microorganisms. As model organisms served Ammonia-Oxidizing Bacteria (AOB), the key players in the global nitrogen cycle, which are present in natural and man-made habitats world wide. Due to their autotrophic way of life, the metabolically active AOB are suited for labeling studies in presence of radioactive CO2, a feature that was exploited for operability tests of the Isotope Array. For the proof of principle an Isotope Array prototype was constructed, which consisted of six previously published oligonucleotide probes detecting the 16S rRNA of AOB. At first the rRNA of a pure culture of Nitrosomonas eutropha, which was incubated with 14C-labeled bicarbonate, was hybridized on a microarray. The patterns of fluorescent and radioactive signals proved the presence and the assimilation activity of N. eutropha. In a control hybridization experiment with rRNA of N. eutropha, which was incubated with 14CO2 and the specific nitrification inhibitor Allylthiourea (ATU), only fluorescent but no radioactive signals were observed, indicating the lack of assimilation activity. After successful demonstration of specific incorporation of 14CO2 into rRNA of N. eutropha via the Isotope Array prototype, nitrifying activated sludges of two wastewater treatment plants were used for Isotope Array experiments. Initially, control experiments with standard methods were conducted with both sludges: the AOB communities of both sludges were determined by quantitative FISH analysis, as well as by comparative sequence analysis of the amoA. Then, the 14CO2-assimilation activities of AOB in both sludges (within and without ATU) were monitored for 26 hours by scintillation. Both active sludges exhibited a continuous increase of radioactivity in their biomasses whereas in the inhibited sludges only a minor radioactivity accumulation was observed. Additionally, the 14CO2 assimilation in the biomasses of both sludges was analyzed by FISH-MAR. In both active sludges apparent accumulations of radioactivity in colonies of the nitrifiers were observed but no equivalent accumulations were detected in the inhibited counterparts. Finally, rRNA from both sludges and treatments was hybridized on the Isotope Array prototype. The identity and activity of AOB determined with the Isotope Array coincided with results of control experiments described above. For an encompassing detection of all known AOB on the Isotope Array a new oligonucleotide probe set according to the multiple probe concept was designed. It consisted of 123 predominantly novel probes targeting the 16S rRNA of AOB, and it was evaluated with in vitro transcribed and PCR-amplified rRNA genes of more than 30 AOB pure cultures. Despite of disadvantageous conditions during the evaluation experiments of the probe set (e.g. high room temperature, defects on array spotter) the new AOB microarray could generally be considered as suitable for detection of AOB. Subsequently, the new AOB probe set was applied to the Isotope Array with radioactively and fluorescently labeled rRNA from sludges of two wastewater treatment plants used previously for the Isotope Array prototype. The results of structure-function analyses achieved with the Isotope Array as well as with its prototype turned out to be congruent for both samples, respectively. For future applications, it should however be mentioned that the stringency conditions for the AOB probe set still need to be fine-tuned, and some hybridizations with pure cultures should be repeated in order to clarify signal ambiguities, most probably caused by the defective array spotter. Eventually, the Isotope Array proved to be an efficient molecular tool for structure-activity analyses of AOB with an occurrence of 5-10% in the total biovolume of the samples. The new AOB microarray was also applied to elucidate differences in community structure of AOB in soil lacking and receiving fertilizer, respectively. As noteworthy differences in diversity emerged beyond the species level and thus beyond the detection limit of the AOB microarray, the AOB population studies of both soils were conducted by comparative amoA gene sequence analysis. It revealed that (i) the differences in AOB community structures between both soils lied on a low phylogenetic level (probably on strain level), and (ii) that the manure-fertilized soil contained less operational taxonomic units (OTU) of AOB than the unfertilized soil did. Furthermore, the AOB populations were analyzed at the grain size level in both soils (coarse and fine sand, silt and clay), considered as microhabitats, showing for both soils that the AOB diversity increased when the particle size decreased (silt and clay). Additionally, some OTU were present in all particle sizes of both soils whereas other few OTU were limited to one soil or its few fractions, dividing the AOB detected into generalists and specialist, respectively. The vast AOB diversity in both soils revealed on one hand, that for investigation of such complex communities further experiments with more replicates are necessary in order to validate present results. On the other hand, again it became obvious that soil molecular microbial ecology is an emerging discipline with great need for research and a multitude of thrilling questions to be answered.     «

Deciphering the structure and function of complex microbial communities is one of the central themes in microbial ecology. Therefore, new molecular detection systems are required, which allow the investigation of phylogeny and function of numerous microorganisms in one step. This work presents the development, evaluation and application of a novel molecular tool for structure-function analyses called the Isotope Array. This approach merges two methods: the highly parallel microarray technique fo...     »