In den letzten Jahren wurden zur Immuntherapie von Tumorerkrankungen vermehrt bispezifische F(ab)2-Fragmente entwickelt. Insbesondere wird die Strategie verfolgt, cytotoxische Effektorzellen durch spezifische Vermittlung eines Kontakts zwischen den Tumorzellen und dem tumorassoziierten Antigen lokal zu aktivieren. Beispielsweise wird die Therapie des Hodgkin-Lymphoms angestrebt, indem das Fab-Fragment HRS3 einerseits das Antigen CD30 auf den lymphatischen Tumorzellen erkennt und andererseits das Antikörperfragment A9 den Fc-gamma-Rezeptor III (CD16) auf natürlichen Killerzellen bindet und aktiviert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die proteinchemischen Grundlagen für die Konstruktion eines humanisierten bispezifischen F(ab)2-Fragments zum Zweck der Tumortherapie refraktärer Hodgkin-Lymphome zu schaffen. Um die Antigene CD16 und CD30 in ausreichender Quantität und Qualität zu produzieren, wurden Vektoren für die Expression der extrazellulären Domänen als Fusionsproteine mit dem Strep-tag-Affinitätsanhängsel im Periplasma von E. coli konstruiert. Beim CD16-Antigen ließ sich auf diese Weise der die Aminosäuren 3-176 umfassende Bereich (CD16B) mit der kompletten extrazellulären Domäne mit Ausbeuten von 50 µg/L Kulturmedium (OD550 = 1) in löslicher Form gewinnen. Im Fall des CD30-Antigens mit seiner in zwei Subdomänen untergliederten extrazellulären Region wurde ein Fragment mit der C-terminalen Subdomäne (Aminosäuren 185-335; CD30A) für die gentechnische Herstellung ausgewählt, das sich mit Ausbeuten von 100 µg/L Kulturmedium (OD550 = 1) produzieren ließ. Mit Hilfe des Quadromantikörpers A9/HRS3 konnte sowohl im ELISA als auch mittels Oberflächenplasmon-Resonanzspektroskopie gezeigt werden, daß die rekombinanten Antigenfragmente CD16B und CD30A jeweils dasjenige Epitop trugen, welches vom entsprechenden Fab-Teil des bispezifischen Antikörpers erkannt wird. Ebenso wurde die spezifische Interaktion der in E. coli funktionell hergestellten chimären Fab-Fragmente muA9 und muHRS3c mit den entsprechenden rekombinanten Antigenfragmenten nachgewiesen und durch Gleichgewichtsanalyse folgende Dissoziationskonstanten ermittelt: muA9: 49.1 ± 2.8 nM; muHRS3c: 25.9 ± 2.8 nM. In guter Übereinstimmung dazu sind die aus der kinetischen Analyse ermittelten Dissoziationskonstanten. Die Auswertung der Kinetik ergab für die Komplexbildung aus dem muA9 Fab-Fragment und CD16B eine Geschwindigkeitskonstante kon von 2.4*105 M-1s-1 und für die Dissoziation eine koff von 1.5*10-2s-1, woraus sich eine Dissoziationskonstante von 63 nM errechnet. Für die Bildung des Komplexes aus dem muHRS3c Fab-Fragment und CD30A wurde eine kon von 8.6*104 M-1s-1 und für die Dissoziation eine koff von 2.0*10-3s-1 bestimmt, was eine Dissoziationskonstante von 24 nM ergab. Für die kovalente Kopplung zweier Fab-Fragmente zum F(ab)2-Fragment wurden zwei Sequenzmotive mit zwei bzw. einem freien Cysteinrest am C-Terminus der leichten Immunglobulinkette entwickelt. Mit Hilfe des Sequenzmotivs mit zwei freien Cysteinresten konnten die beiden Fab-Fragmente muA9 und muHRS3c über Disuldfidbrücken mit einer Kopplungsausbeute von 70 % zum F(ab)2-Fragment verknüpft werden. Im ersten Schritt dieses zweistufigen Kopplungsverfahrens wurden die freien Cysteinreste des muHRS3c Fab-Fragments in einer Thiol/Disulfidaustauschreaktion mit dem Ellman´s Reagenz DTNB derivatisiert. Nach Isolierung des entstandenen gemischten Disulfids wurde dieses mit dem muA9 Fab-Fragment in einer weiteren Thiol/Disulfidaustauschreaktion umgesetzt. Im Falle des Sequenzmotivs mit nur einem freien Cysteinrest gelang die Kopplung nach diesem Verfahren mit Ausbeuten von 55 %. Außerdem konnten zwei muHRS3c Fab-Fragmente mit zwei freien Cysteinresten über Thioetherbindungen mittels dem Linkerreagens o-Phenylendimaleimid regioselektiv mit Ausbeuten von 30-40 % zum bivalenten F(ab)2-Fragment gekoppelt werden. Um die Immunogenität der murinen variablen Domänen des Fab-Fragments zu reduzieren, wurde in dieser Arbeit der HRS-Antikörper mittels CDR-Transplantation humanisiert. Das resultierende humanisierte huHRS3 Fab-Fragment wurde in E. coli produziert und durch Metallchelat-Affinitätschromatographie gereinigt. Die mittels Oberflächenplasmon-Resonanzspektroskopie bestimmte Dissoziationskonstante war mit 278 ± 61 nM um Faktor 10 geringer war als die des zugrundeliegenden chimären muHRS3c Fab-Fragments. Die Untersuchung zur Ursache des Verlustes an Antigenaffinität anhand hybrid gepaarter variabler Domänen ergab, daß dieser Effekt hauptsächlich auf die humanisierte VH-Domäne zurückzuführen war. Diese wurde daher einer in vitro-Affinitätsmaturierung unterzogen. Mittels Error Prone PCR wurde eine huVH-Genbibiliothek mit Zufallsmutationen präpariert und diese in Form des rekombinanten Fab-Fragments im Kolonie-Filterstapel-Test auf verbesserte Bindung des markierten CD30A-Antigens durchmustert. Nach dreimaligem Durchlaufen des Affinitätsmaturierungszyklus wurde die Variante EP3/1 isoliert, welche insgesamt vier Aminosäuresubstitutionen zwei in FR-H3 und zwei in CDR-H3 aufwies. Im ELISA bzw. FACS zeigte diese Mutante ein nahezu identisches Bindungsverhalten an rekombinantes CD30A-Antigen bzw. CD30-positive L540 CY-Zellen wie das ursprüngliche chimäre muHRS3c Fab-Fragment. Die mittels Oberflächenplasmon-Resonanzspektroskopie für die Variante EP3/1 ermittelte Dissoziationskonstante nach der Gleichgewichtsanalyse betrug 58 ± 10 nM und war somit im Vergleich zum ursprünglich humanisierten HRS3 Fab-Fragment um den Faktor 5 verbessert. Die Auswertung der Kinetik ergab für die Komplexbildung eine Geschwindigkeitskonstante kon von 5.1*104 M-1s-1 und für die Dissoziation eine koff von 2.0*10-3 s-1, woraus sich eine Dissoziationskonstante von 40 nM errechnet. Damit sind die Voraussetzungen geschaffen, um in Kombination mit einem humanisierten anti-CD16 Fab-Fragment ein vollständig humanisiertes bispezifisches anti-CD16/anti-CD30 F(ab)2-Fragment in ausreichenden Mengen zu ökonomischen Bedingungen für Tierversuche und spätere therapeutische Anwendungen bereitzustellen.
Translated abstract:
In the last few years the immunotherapy of tumour diseases with bispecific F(ab)2 fragments became more and more interesting. Especially the strategy of activating cytotoxic effector cells by crosslinking them with tumour cells via the tumour associated antigen is promising. For example, this method can be used to therapy the Hodgkin lymphoma disease. Then, one arm of the bispecific construct, the Fab fragment HRS3, binds to the CD30 on lymphatic tumour cells, and the other, the A9 Fab fragment, binds to the Fc-gamma receptor III on natural killer cells and activates them. The aim of this thesis was the development of the proteinchemical basis for the construction of a humanized bispecific F(ab)2 fragment for immunotherapy of the Hodgkin lymphoma disease. To produce the antigens CD16 and CD30 in sufficient quantity and quality in E. coli vectors for the periplasmic expression of the extracellular domains as fusion proteins with the Strep-tag were constructed. Regarding the CD16 antigen the region with the amino acids 3-176 (CD16B) with nearly the complete extracellular domain could be isolated in soluble form with yields of 50 µg/L culture (OD550=1). In the case of the CD30 antigen with its extracellular domain divided in two subdomains a fragment with the C-terminal subdomain (amino acids 185-335; CD30A) was chosen for production. The yield was 100 µg/L culture (OD550=1). The binding of the original bispecific anti-CD16/anti-CD30 (A9/HRS3) monoclonal mouse antibody to the recombinant antigens CD16B and CD30A revealed that they carried the epitope recognized by the corresponding Fab-part of the bispecific A9/HRS3 monoclonal mouse antibody. Also, the specific interaction of the chimaeric Fab fragments muA9 and muHRS3c that were produced in E. coli could be detected. Following dissociation constants were determined by equilibrium analysis using surface plasmon resonance spectroscopy: muA9: 49.1 ± 2.8 nM, muHRS3c: 25.9 ± 2.8 nM. In good agreement to these are the dissociation constants from the kinetic analysis. For the formation of the complex between the chimaeric muA9 Fab fragment and CD16B the kinetic association constant kon was 2.4*105 M-1s-1, whereas the kinetic dissociation constant koff was 1.5*10-2s-1, yielding a dissociation constant of 63 nM. For the formation of the complex between the chimaeric muHRS3c Fab fragment and CD30A kon was 8.6*104 M-1s-1 and for the dissociation koff was 2.0*10-3s-1, resulting in a dissociation constant of 24 nM. For covalently coupling two Fab fragments to a F(ab)2 fragment two sequence motifs with one or two free cysteine residues at the C-terminus of the light chain were developed. Using the sequence motif with two free cysteine residues the two chimaeric Fab fragments muA9 and muHRS3c could be linked via disulfid bonds. The coupling efficiency was about 70 %. In the first step of this two-step coupling procedure the free cysteine residues of the chimaeric muHRS3c Fab fragment were reacted with Ellman´s Reagent DTNB in a thiol/disulfid exchange reaction. After isolation of the produced mixed disulfid it was reacted with the muA9 Fab fragment in a second thiol/disulfid exchange reaction. In the case of the sequence motif with only one free cysteine residue the coupling efficiency was about 55 %. Moreover, two chimaeric muHRS3c Fab fragments with two free cysteine residues could be linked to a bivalent F(ab)2 fragment via thioether bonds using the chemical linker o-phenylendimaleimide. The coupling efficiency was about 30-40 %. To reduce the immunogenicity of the murine variable domains the chimaeric muHRS3 Fab fragment was humanized by CDR grafting. The resulting humanized huHRS3 Fab fragment was produced in E. coli and purified by metal-chelat affinity chromatography. The dissociation constant determined by using surface plasmon resonance spectroscopy was 278 ± 61 nM and therefore a factor ten lower than for the original chimaeric muHRS3c Fab fragment. The analysis of the decrease in affinity revealed that this effect was mainly due to the humanized VH domain. Therefore, this domain was affinity maturated. Using error prone PCR a huVH gene library with random mutations was prepared. The corresponding Fab fragments were screened for improved binding towards CD30A antigen using a filter sandwich colony screening assay. After three rounds of this affinity maturation cycle the variant EP3/1 could be isolated. It contained four amino acid substitutions, of which two were in FR-H3 and two in CDR-H3. In ELISA and FACS this mutant revealed nearly identical binding towards recombinant CD30A antigen and CD30+ L540 CY-cells as the original chimaeric muHRS3c Fab fragment, respectively. The dissociation constant for the variant EP3/1 determined by equilibrium analysis was 58 ± 10 nM. Compared to the original humanized HRS3 Fab fragment the affinity could be improved by a factor of five. The kinetic analysis revealed for the complex formation a kinetic association constant kon = 5.1*104 M-1s-1 and for the complex dissociation a kinetic dissociation constant koff = 2.0*10-3 s-1, revealing a dissociation constant of 40 nM. Now, in combination with a humanized anti-CD16 Fab fragment a completely humanized bispecific anti-CD16/anti-CD30 F(ab)2 fragment can be produced in a sufficient amount for further studies.
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