Epidemiologische Studien zeigen weltweit eine steigende Häufigkeit und einen zunehmenden Schweregrad des atopischen Ekzems beim Menschen. Ziel der vorliegenden Arbeit war, in in vitro Experimenten eine mögliche ursächliche Beteiligung der umweltrelevanten Luftschadstoffe Toluol und m-Xylol zu untersuchen. Hierfür wurde eine Expositionsapparatur in Form eines offenen, kontinuierlich gasdurchströmten Systems konstruiert, das die simultane Exposition von 12 submersen oder 6 luftexponierten Zellkulturen gegenüber Substanzen aus der Gasphase ermöglicht. Die Apparatur eignet sich aufgrund der Langzeitstabilität physikalisch-chemischer und biologischer Betriebsparameter für Langzeitexpositionen, aufgrund ihrer Dichtigkeit für den Einsatz hochtoxischer Substanzen. Ferner wurden Zellisolierungs- und Kultivierungsmethoden entwickelt, um sterile, homogene und proliferierende Primärkulturen aus humaner Haut von hautgesunden Probanden und Patienten mit atopischem Ekzem zu gewinnen. Eine Dekontaminationsmethode für Hautproben und Keratinozytenkulturen mit 1 % Flucloxacillin gegen die im atopischen Ekzem häufige, multiresistente Staphylococcus aureus Infektion verbesserte den Anteil erfolgreicher Isolierung und Kultivierung proliferierender Primärkeratinozyten aus atopischem Ekzem von 30 % auf 90 %, vergleichbar mit Keratinozyten aus gesunder Haut. Das Differenzierungs- und Zytokinsezernierungsverhalten von Keratinozytenkulturen aus läsionaler und ekzemfreier Haut desselben Probanden mit atopischem Ekzem unterschied sich signifikant. Das war ein klarer Hinweis darauf, dass tatsächlich Keratinozyten läsionalen Ursprungs kultiviert wurden. Darüber hinaus wurden organrekonstruierende Methoden für die Entwicklung eines dreidimensionalen, humanen in vitro -Modells für das atopische Ekzem evaluiert, wobei sich humane tote Dermis als geeignetste Biomatrix erwies. Unter Einsatz der Expositionsapparatur wurden schließlich humane Keratinozyten aus atopischer und gesunder Haut gegenüber VOC (flüchtige organische Substanzen)-Konzentrationen im umwelt- und arbeitsplatzrelevanten Bereich exponiert. Anhand der Zytokinfreisetzung wurden erste Erkenntnisse über eine mögliche ursächliche Beteiligung von umweltrelevanten Luftschadstoffen an der weltweit steigenden Häufigkeit und am zunehmenden Schweregrad des atopischen Ekzems beim Menschen gewonnen: Keratinozyten aus Atopikerhaut setzten konstitutiv im Mittel doppelt so hohe GM-CSF- und IL-6-Konzentrationen frei wie die Zellen gesunder Probanden. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass die im atopischen Ekzem in situ nachgewiesenen erhöhten Zytokinkonzentrationen u. a. keratinozytären Ursprungs sind. Die konstitutive wie auch die VOC-induzierte Zytokinfreisetzung von IL-1a, IL-6 und GM-CSF aus Keratinozyten läsionaler und nicht läsionaler Haut desselben Probanden unterschied sich signifikant. Daraus folgt, dass in in vitro Untersuchungen zwischen Keratinozyten aus läsionaler und ekzemfreier Atopikerhaut unterschieden werden muss. Vor allem Keratinozyten aus atopisch läsionaler Haut reagierten aus ihrem proinflammatorischen Status heraus empfindlicher auf VOC. Die Ergebnisse unterstützten die allergotoxikologische These von der VOC-sensitiveren atopischen Haut. Da die Auslöser des atopischen Ekzems stark patientenabhängig sind, zeigte nur eine Untergruppe der Probanden eine erhöhte VOC-Empfindlichkeit. Weitere Ergebnisse dieser Arbeit deuten auf synergistische, multiplikative Kombinationswirkungen von niedrigkonzentrierten, umweltrelevanten VOC-Gemischen auf die in vitro Zytokinfreisetzung von IL-1a, IL-6 und GM-CSF aus Keratinozyten gesunder Haut hin. Beispielsweise entsprach die verstärkte GM-CSF-Freisetzung der Sekretion nach 3 MAK (maximale Arbeitsplatzkonzentration) Toluol-Exposition. Auf Zellen aus atopischem Ekzem zeigten sich keine Kombinationseffekte. Allerdings sezernierten Zellen von Atopikern höhere Absolutkonzentrationen als Zellen gesunder Probanden. Das bedeutet zum einen, dass bei der Beurteilung von umweltrelevanten Einflüssen auf gesunde Haut die MAK-Größen nicht ohne weiteres als Bewertungsmassstab herangezogen werden können, da diese keine Kombinationseffekte berücksichtigen. Zum anderen lässt sich - nach den Ergebnissen des in der vorliegenden Arbeit angewendeten in vitro Expositionssystems - der epidemiologisch beobachtete Prävalenzanstieg des atopischen Ekzems nicht mit der Wirkung des umweltrelevant konzentrierten VOC-Gemischs insbesondere auf Primärkeratinozyten aus atopischem Ekzem begründen. Die Dissertation behandelt eine auf Methoden- und Geräteentwicklung basierende experimentelle Arbeit im Fachgebiet der Allergotoxikologie. Alle entwickelten Verfahren wie auch die Apparatur können auch im Rahmen weiterer Fragestellungen eingesetzt werden.     «

Epidemiologische Studien zeigen weltweit eine steigende Häufigkeit und einen zunehmenden Schweregrad des atopischen Ekzems beim Menschen. Ziel der vorliegenden Arbeit war, in in vitro Experimenten eine mögliche ursächliche Beteiligung der umweltrelevanten Luftschadstoffe Toluol und m-Xylol zu untersuchen. Hierfür wurde eine Expositionsapparatur in Form eines offenen, kontinuierlich gasdurchströmten Systems konstruiert, das die simultane Exposition von 12 submersen oder 6 luftexponierten Zellkult...     »

Epidemiological studies indicate worldwide raising prevalence and severity of atopic dermatitis in human beings. The goal of the present thesis was to investigate a potential causal contribution of the environmentally relevant airborne pollutants toluene and m-xylene in in vitro experiments. For this purpose, an exposure system for gasous compounds was developed consisting of an open, continuously gas-flooded system which enables the simultaneous exposition of twelve submerse or of six air exposed cell cultures towards substances out of the gas phase. The system is suited for long-time exposures due to the longtime stability of the physical-chemical and the biological operating parameters as well as for the application of highly toxical substances due to its tightness. Moreover, methods to isolate and cultivate cells were developed to get sterile, homogeneous and proliferating primary cell cultures of human skin from both subjects with healthy skin as well as from patients suffering from atopic dermatitis. A method to decontaminate skin samples and keratinocyte cultures from the often occurring infection with multiresistent Staphylococcus aureus by means of 1% flucloxacillin improved the percentage from 30% to 90% of successfully isolated and cultivated, proliferating primary keratinocytes from atopic dermatitis skin, comparable with the keratinocytes from healthy skin. The differentiation and the secretion of cytokines from cultures of keratinocytes from lesional skin was significantly different to those of eczema-free skin of the same patient with atopic dermatitis. This was a clear hint for cultivation of keratinocytes from real lesional origin. Furthermore, methods to reconstruct organs in culture were evaluated to develope a three-dimensional human in vitro model of the atopic dermatitis, with dead human dermis found to be the most suited biomatrix. Finally, applying the exposition system, human keratinocytes from atopic and healthy skin were exposed towards VOC concentrations of an order of magnitude relevant for environmental and work-place exposures. From the release of cytokines, first insights were found about a potential causal contribution of environmentally relevant airborne pollutants to the worldwide increasing prevalence and incidence of the atopic dermatitis in human beings: On the average, keratinocytes from the skin of atopics released constitutively twice the concentrations of GM-CSF and IL-6 compared to cells of healthy subjects. These results indicate that the increased concentrations of cytokines in atopic dermatitis, found in situ , are originating among other things from keratinocytes. The constitutive as well as the VOC (volatile organic compounds)-induced release of IL-1a, IL-6 and GM-CSF from keratinocytes of lesional and non-lesional skin of the same subject were sigificantly different. This means that in in vitro experiments the keratinocytes from lesional skin have to be distinguished from keratinocytes from non-lesional skin of atopics. Especially keratinocytes from atopic lesional skin reacted more sensitively towards VOC with respect to there pro-inflammatory state. These results support the allergotoxicological hypothesis of the more VOC-sensitive atopic skin. As the triggers of atopic dermatitis are strongly depending on the individual subject, an increased sensitivity towards VOC was found only for a subgroup of subjects. Further results indicate that there is a synergistic, multiplicative combination of impacts of low-concentrated, environmentally relevant mixtures of VOC on the in vitro secretion of cytokines from keratinocytes of healthy skin. For example, the increased secretion of GM-CSF resembled that one after an exposition of three MAK (maximum concentrations at the workplace) toluene. In contrast, no combinatory effect was found in atopic dermatitis. But the level of cytokines secreted by cells of atopic patients was higher than the one secreted by keratinocytes of healthy subjects. This means that the MAK values cannot be used offhand to evaluate the environmentally relevant influence on healthy skin, because these values do not take into account combinatory effects. On the other hand, the results of the in vitro exposure system applied in the present work do not induce that the increased prevalence of atopic dermatitis - observed from epidemiological studies - is due to the impact of the environmentally concentrated VOC mixture especially on primary keratinocytes from atopic dermatitis. This thesis comprises an experimental work in the subject of allergotoxikology based on the development of methods and equipment in form of an exposure system for cell cultures towards gasous compounds. All methods as well as the exposure system can also be used for investigations of other questions.     «

Epidemiological studies indicate worldwide raising prevalence and severity of atopic dermatitis in human beings. The goal of the present thesis was to investigate a potential causal contribution of the environmentally relevant airborne pollutants toluene and m-xylene in in vitro experiments. For this purpose, an exposure system for gasous compounds was developed consisting of an open, continuously gas-flooded system which enables the simultaneous exposition of twelve submerse or of six air expos...     »