Die Identifikation der Bindungspartner von Bcr-Abl ist von großem wissenschaftlichem Interesse, um die molekulare Pathogenese der CML auf zellulärer Ebene weiter zu entschlüsseln. Mittels eines modifizierten Yeast two-hybrid-Systems mit Bcr-Abl als Köderprotein und einer cDNA-Bibliothek aus der CML-Zellinie K562 wurde die phosphotyrosinunabhängige Interaktion von Bcr-Abl mit dem Klon F6 nachgewiesen. Mittels RACE-Methode wurde die komplette cDNA kloniert. Das von diesem Gen kodierte Protein weist eine signifikante Homologie zu dem Cas-Protein HEF1/Cas-L auf. Aufgrund seiner Analogie zu dem Cas-Protein HEF1 wurde dieses neue Gen HEFL (HEF-Like) genannt. Northern Blot-Analysen zeigten, daß HEFL ubiquitär in verschiedenen Geweben exprimiert war mit verstärkter Expression in peripheren Blutleukozyten und Milz. Es wurde ein Antikörper gegen den N-Terminus von HEFL hergestellt. Damit gelang die spezifische Detektion von HEFL als Protein von 105 kD Größe im Western Blot sowie die Immunpräzipitation von endogenem und überexprimiertem HEFL. In GST-Bindungsstudien und in Koimmunpräzipitationsstudien konnte eine Interaktion von HEFL mit Bcr-Abl sowohl im humanen Zellysat semi-in-vivo bzw. in vivo nachgewiesen werden. Dabei konnte gezeigt werden, daß die Assoziation von HEFL mit Bcr-Abl zumindest teilweise über die SH3-Domäne von HEFL und wahrscheinlich den C-Terminus von Abl im Bcr-Abl-Protein vermittelt wird. Experimente mit kinaseinaktiven Mutanten von Bcr-Abl bestätigten die in Hefe beobachtete Phosphotyrosinunabhängigkeit der Interaktion von HEFL mit Bcr-Abl. Dabei konnte gezeigt werden, daß HEFL durch die Assoziation mit Bcr-Abl phosphoryliert wird.     «

Die Identifikation der Bindungspartner von Bcr-Abl ist von großem wissenschaftlichem Interesse, um die molekulare Pathogenese der CML auf zellulärer Ebene weiter zu entschlüsseln. Mittels eines modifizierten Yeast two-hybrid-Systems mit Bcr-Abl als Köderprotein und einer cDNA-Bibliothek aus der CML-Zellinie K562 wurde die phosphotyrosinunabhängige Interaktion von Bcr-Abl mit dem Klon F6 nachgewiesen. Mittels RACE-Methode wurde die komplette cDNA kloniert. Das von diesem Gen kodierte Protein weis...     »

Using the yeast two hybrid screen with Bcr-Abl as bait and a K562 cDNA library, the cDNA fragment encoding the SH3 domain of a novel member of the Cas familiy of proteins was isolated. RACE helped to define the complete cDNA sequence. This cDNA showed highest homology to HEF1/Cas-L and was therefore named HEFL (HEF-like). Northern blot analysis revealed that most transcripts are present in peripheral blood leukocytes and spleen. An anitbody raised against the HEFL N-terminus specifically detected HEFL in Western blot analysis and immunoprecipitated endogenous and overexpressed HEFL. HEFL bound to Bcr-Abl semi-in-vivo and in vivo in a tyrosine kinase-independent manner as analysed in yeast, GST-binding experiments and coimmunoprecipitation studies. This interaction was mediated at least in part by the SH3 domain of HEFL and the Abl portion of Bcr-Abl. The interaction of HEFL with Bcr-Abl led to phosphorylation of HEFL.     «

Using the yeast two hybrid screen with Bcr-Abl as bait and a K562 cDNA library, the cDNA fragment encoding the SH3 domain of a novel member of the Cas familiy of proteins was isolated. RACE helped to define the complete cDNA sequence. This cDNA showed highest homology to HEF1/Cas-L and was therefore named HEFL (HEF-like). Northern blot analysis revealed that most transcripts are present in peripheral blood leukocytes and spleen. An anitbody raised against the HEFL N-terminus specifically detecte...     »