Mithilfe der denaturierenden HPLC wurde eine Mutationsanalyse des gesamten kodierenden Abschnitts des DPYD-Gens durchgeführt. Für jedes Exon und teilweise für einzelne Fragmente eines Exons wurden die optimale DHPLC-Temperatur und der Elutionsgradient anhand von Berechnung sowie experimentell ermittelt, so dass durch das jeweilige Chromatogramm eine definitive Zuordnung zu Wildtyp oder zu spezifischen bekannten Mutanten möglich wurde; stichprobenartige Kontrollen bestätigten in der Sequenzierung den erwarteten Genotyp. Somit wurde die Sequenzierung nur bei neuen oder unklaren Chromatogrammen bzw. Genotypen nötig. Ebenso konnte nach Evaluierung der exakten Analysenbedingungen mittels der optimierten DHPLC ein zeitlich wenig aufwendiges Screening einer großen Probandengruppe durchgeführt werden: bei einer durchschnittlichen Analysendauer von 6-8 min pro Einzelprobe und automatischer Probenapplikation konnten innerhalb relativ kurzer Zeit große Probenmengen bewältigt werden. Die Mutationsanalyse der Normalpopulation zeigt eine Vielfalt an Mutationen: sowohl im kodierenden als auch in Intron-Abschnitten des DPYD-Gens konnten insgesamt 23 Variationen identifiziert werden, davon drei bisher unbekannte Varianten. Im Patientenkollektiv konnte zusätzlich eine bisher nicht beschriebene Mutation entdeckt werden. Zur Klärung, welche der Mutationen für eine herabgesetzte Enzymaktivität und konsekutiv für DPD-Defizienz verantwortlich ist, wurden die genetischen Daten mit funktionellen Daten in Korrelation gesetzt: Zusammen mit DPD-Aktivitätswerten, Daten zur dreidimensionalen Proteinstruktur und statistischer Analyse konnten einige Mutationen als harmlose Polymorphismen beurteilt werden, während hingegen einige Mutationen der weiteren Untersuchung bedürfen. Schließlich lassen sich einige wenige Mutationen tendenziell als funktionsbeeinträchtigende bezeichnen: Die in der Literatur beschriebene Intron 14 Splice-Mutation trat in unserem Kollektiv nicht auf; jedoch lässt sich eine Funktionseinschränkung erklären: das Exon 14 wird herausgespleißt, somit fehlt die durch das Exon 14 kodierte Uracilbindestelle. In unserem Kollektiv trat die Mutation im Exon 4 auf, die hinlänglich aus der Literatur bekannt durch Wegfall dreier Basen ein verschobenes Leseraster bewirkt und folglich ebenso ein in der Funktionalität gestörtes Protein produziert. Durch die Korrelation mit der funktionellen Diagnostik lassen sich zwei Mutationen mit statistischer Signifikanz einer herabgesetzten Enzymaktivität zuordnen: 2846A>T (Asp949Val) und 1601G>A (DPYD*4, Ser534Asn); ebenfalls bei Betrachtung der Analyse der dreidimensionalen Struktur erhärtet sich der Hinweis auf eine Beeinträchtigung der Enzymfunktion bei vorliegenden Mutationen. Unsere Untersuchung an der Normalpopulation bestätigt frühere Studien, die eine Inzidenz von 1-3% von genetischen DPD-Defekten beschreiben. Deshalb ist das Risiko des Individuums, unter Chemotherapie mit Fluoropyrimidin-haltigen Substanzen eine schwere toxische Reaktion zu erleiden, zwar gering, jedoch nicht zu vernachlässigen. Somit ist ein prätherapeutisches Screening auf genetische Defekte mittels schneller und wenig zeit- und kostenintensiver Methoden indiziert: die Möglichkeit der DHPLC wäre diesem Zweck entsprechend. Jedoch bis zur endgültigen Differenzierung von harmlosen Polymorphismen und therapierelevanten Mutationen sind weitere Untersuchungen nötig: anschließend an die Analyse der Normalpopulation wurde mit einer Studie an einem Patientenkollektiv begonnen.
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Mithilfe der denaturierenden HPLC wurde eine Mutationsanalyse des gesamten kodierenden Abschnitts des DPYD-Gens durchgeführt. Für jedes Exon und teilweise für einzelne Fragmente eines Exons wurden die optimale DHPLC-Temperatur und der Elutionsgradient anhand von Berechnung sowie experimentell ermittelt, so dass durch das jeweilige Chromatogramm eine definitive Zuordnung zu Wildtyp oder zu spezifischen bekannten Mutanten möglich wurde; stichprobenartige Kontrollen bestätigten in der Sequenzierun...
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