26S Proteasomen aus Drosophila melanogaster sind hinsichtlich ihrer Stabilität jenen aus vielen anderen Organismen überlegen und daher besonders für Strukturuntersuchungen geeignet. Für eine biochemische Charakterisierung wurden im Zuge dieser Arbeit 26S Proteasomen aus D. melanogaster Embryonen gereinigt und mittels 2D Gelelektrophorese aufgetrennt. Die Untereinheiten des Regulatorischen Komplexes (RC) wurden mittels Aminosäuresequenzierung und anschließender Sequenzierung der korrespondierenden cDNA identifiziert. 17 Untereinheiten des Drosophila RC haben Homologe in den RC von Hefe und Mensch. Eine zusätzliche Untereinheit, p37A, die bis jetzt in anderen Organismen noch nicht beschrieben wurde, gehört zur Familie der Ubiquitin - C-terminalen - Hydrolasen (UCH). Unter Ausnützung der kovalenten Bindung des nicht hydrolysierbaren Substratanalogen, Ubiquitinaldehyd, an p37A konnte erstmals mittels Elektronenmikroskopie die Lage einer Untereinheit im Regulatorischen Komplex direkt bestimmt werden. Die Massen des 26S Proteasoms mit einem oder zwei RC wurde mit Hilfe von Rastertransmissions-Elektronenmikroskopie (STEM) ermittelt; die daraus berechnete Masse des Regulatorischen Komplexes beträgt 894 kD. Dieser Wert entspricht ziemlich genau der Summe der Massen der 18 Untereinheiten von 932 kD; folglich wurden tatsächlich alle RC Untereinheiten durch die 2D Gelelektrophorese detektiert. p37A und andere Untereinheiten des Drosophila 26S Proteasoms wurden molekularbiologisch mit einem Epitop versehen und in stabil transfizierten Drosophila Schneider S2 Zellen überexprimiert. Diese Fusionsproteine wurden von den Zellen in Proteasomen eingebaut und über Epitop-spezifische Affinitätschromatographie gereinigt. Neben den freien Untereinheiten konnten mit dieser Methode 20S Proteasomen bzw. Regulatorische Komplexe, jedoch keine kompletten 26S Proteasomen isoliert werden. Die Epitop-markierten Komplexe könnten sich in Zukunft als nützlich für die Lokalisierung einzelner Untereinheiten mittels Immunoelektronenmikroskopie erweisen.     «

26S Proteasomen aus Drosophila melanogaster sind hinsichtlich ihrer Stabilität jenen aus vielen anderen Organismen überlegen und daher besonders für Strukturuntersuchungen geeignet. Für eine biochemische Charakterisierung wurden im Zuge dieser Arbeit 26S Proteasomen aus D. melanogaster Embryonen gereinigt und mittels 2D Gelelektrophorese aufgetrennt. Die Untereinheiten des Regulatorischen Komplexes (RC) wurden mittels Aminosäuresequenzierung und anschließender Sequenzierung der korrespondierende...     »

Drosophila melanogaster embryos are a source for homogeneous and stable 26S proteasomes suitable for structural studies. For biochemical characterization, purified 26S proteasomes were resolved by two-dimensional (2D) gel electrophoresis and subunits composing the regulatory complex (RC) were identified by amino acid sequencing and immunoblotting, before corresponding cDNAs were sequenced. 17 subunits from Drosophila regulatory complexes were found to have homologues in the yeast and human RCs. An additional subunit, p37A, not yet described in RCs of other organisms, is a member of the Ubiquitin Carboxyl-terminal Hydrolase family (UCH). Analysis of electron microscopy images of 26S proteasomes-UCH-inhibitor complexes allowed for the first time to localize one of the RC's specific functions, deubiquitylating activity. The masses of 26S proteasomes with either one or two attached RCs were determined by Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) yielding a mass of 894 kD for a single RC. This value is in good agreement with the summed masses of the 18 identified RC subunits (932 kD), indicating that the number of subunits is complete. p37A and additional subunits were molecularbiologically tagged with an epitope and overexpressed in stable transfected Drosophila Schneider S2 cells. The fusion-proteins were incorporated into the proteasomes by the cells and were purified with an epitope-specific affinitychromatography. In addition to the free subunits 20S proteasomes and RCs culd be isolated, but no complete 26S proteasomes. In future these epitope-tagged complexes could serve for the localization of single subunits by means of immuno-electron microscopy     «

Drosophila melanogaster embryos are a source for homogeneous and stable 26S proteasomes suitable for structural studies. For biochemical characterization, purified 26S proteasomes were resolved by two-dimensional (2D) gel electrophoresis and subunits composing the regulatory complex (RC) were identified by amino acid sequencing and immunoblotting, before corresponding cDNAs were sequenced. 17 subunits from Drosophila regulatory complexes were found to have homologues in the yeast and human RCs....     »